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近日，中國海洋大學海洋生命學院藻類生物技術與遺傳育種實驗室隋正紅教授團隊在龍須菜基因編輯體系構建方向取得重要進展，研究成果“CRISPR/LbCas12a-mediatedtargetedmutationofGracilariopsislemaneiformis（CRISPR/LbCas12a介導的龍須菜靶基因突變）”在線發(fā)表于植物學知名期刊PlantBiotechnologyJournal。文章首次報道了在紅藻龍須菜中基于CRISPR/LbCas12a基因編輯系統(tǒng)實現(xiàn)目標基因的突變，該研究也為大型海藻基因編輯技術體系構建提供了重要參考。

龍須菜是一種重要的大型經濟海藻，是瓊膠的主要原材料和鮑魚的餌料，但是目前缺乏對龍須菜進行遺傳改造的技術手段，限制了龍須菜的高效育種開發(fā)。由于大型海藻特殊的生物學特性，目前尚未有成功實現(xiàn)基因編輯的報道。為了解決這一難題，研究團隊制定了通過基因槍轉化Cas12a蛋白與gRNA復合體的方案，大大簡化了實驗流程。CRISPR/LbCas12a系統(tǒng)是一種高效的基因編輯手段，目前已經成功地應用于多個物種中，實現(xiàn)了基因敲除、激活或抑制。研究團隊在大型海藻龍須菜中實現(xiàn)CRISPR/LbCas12a基因編輯，為龍須菜的基因功能研究提供了重要的技術手段，對遺傳育種具有重要意義。

該研究首先針對龍須菜的一種胞外碳酸酐酶基因設計了6個靶位點，并在體外驗證了針對這6個靶位點的gRNA效率。在這6個靶位點中挑選了兩個效率最高的gRNA，并將它們分別與LbCas12a蛋白孵育形成蛋白質核酸復合體（RNP），使用基因槍分別將各RNP轟擊轉化進龍須菜藻尖中。培養(yǎng)5天后，PCR擴增碳酸酐酶基因，通過單鏈構象多態(tài)性分析（SSCP）將疑似突變的片段富集后進行單克隆測序，檢測到了發(fā)生在靶位點附近的堿基替換結果。為了能夠直觀地區(qū)分轉化細胞和正常細胞，該研究又選擇了藻紅蛋白的γ亞基作為靶基因。針對每一個藻紅蛋白的γ亞基基因，分別設計了兩個靶位點并進行體外效率驗證。將所有靶位點中效率最高的一個gRNA與Cas12a蛋白轉化進入到龍須菜藻尖中。5天后，在熒光顯微鏡下觀察到了龍須菜藻體表面轉化細胞的自發(fā)熒光發(fā)生改變，形成了區(qū)別于正常細胞的“色斑”。通過單克隆測序檢測到了靶位點附近的堿基替換及靶位點上游的堿基插入和缺失。

中國海洋大學海洋生命學院張敬宇、吳瓊及MorganeEléou?t博士為論文的共同第一作者，隋正紅教授和胡依依博士為共同通訊作者。這項工作得到了農業(yè)農村部和財政部國家藻類產業(yè)技術體系和國家自然科學基金項目的資助。

通訊員：王志剛